De acuerdo con los documentos históricos, se fundó en el santoral de San Juan Bautista, que es conocido por ser patrono de lugares donde hay sitios asociados al agua, como el río San Juan que cruza el poblado.
“Salieron y llegaron al puesto, donde está una peña (… ) el día de San Juan (…) ha de ser pueblo si hay manantial”, se lee en la revista Dimensión Antropológica del Instituto Nacional de Antropología e Historia (INAH), haciendo una posible referencia a la fundación de este poblado.
Pues, según Rafael Ayala Echavarri, en “Conquista de Querétaro”, publicado en el Boletín de la Sociedad Mexicana de Geografía y Estadística en 1948, sobresale un documento conservado en un convento franciscano de Roma que detalla algunos aspectos respecto a la fundación de San Juan del Río.
Además, de acuerdo con Francisco Ramos de Cárdenas, escribano de la Relación Geográfica de Querétaro en 1582, se detalla que:
“El pueblo de San Juan del Río fue poblado por un indio de la generación de los otomites, natural del pueblo y cabecera de Xilotepec, que habiendo recibido el agua del santo bautismo, lo llamaron Don Juan y tomó por sobrenombre su nombre primero que tenía en su gentilidad que era Mexitzin, que quiere decir mexicano”.
Fue Juan Mexici el primer cacique del poblado fundado a las orillas del Río San Juan, quien, al ver el avance español en territorio mexica, llegó a poblar con su gente en 1526.
Al momento de la llegada de los conquistadores europeos, no hubo resistencia por parte de los indígenas originarios, así que la conquista de los españoles y sus aliados originarios de Jilotepec fue de manera pacífica.
Se relata que los conquistadores se establecieron unos días antes, esperando precisamente al día de San Juan Bautista para fundar San Juan del Río, un 24 de Junio de 1531.